在现代分子生物学实验室中，聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）技术已经成为一个不可或缺的工具。它允许科学家从极少量的样本中扩增特定的DNA序列，使得研究者能够更准确地分析遗传信息。PCR技术有多种变体，其中热起始PCR和热终止PCR是两种常见的形式，它们在启动和停止反应过程中的策略上存在关键差异。
热起始PCR
理论基础
热起始PCR是一种常用的模板依赖性扩增方法，发明于1985年由Mullis等人提出。这项技术利用一种特殊的酶，即DNA聚合酶，能够在高温下断开双链DNA，并且能在低温下复制新生成的单链模板。在这个过程中，温度控制扮演了至关重要的角色，因为不同温度下的蛋白质结构会发生改变，从而影响其功能。
实践操作
进行热起始PCRs时，一次完整循环通常包括三个阶段：-denaturation-、annealing-、extension-. 在-denaturation-阶段，由于加热到较高温度，大约95°C左右，全长双链DNA被分解成两个单链；接下来，在-annealing-阶段，由于降低到适当温度，大约50-65°C之间，每个单链与其互补序列结合起来形成稳定结构；最后，在-extension-阶段，加温至大约72°C左右，让嵌入已结合好的引物内部，与模板DNA上的相应碱基配对并进行复制。此外，还有一段冷却时间，可以帮助减少非特异性结合。
热终止PCR
理论基础
相比之下，hot-start PCR是一种改进型技术，其核心理念是在整个扩增过程中保持聚合酶处于不活跃状态，只有当需要进行扩增的时候才激活聚合 酶。这可以通过化学抑制剂来实现，这些抑制剂只有在某个特定条件下（如加入引物后），才能被去除，从而使聚合酶获得活化。这种设计可以显著提高扩增效率和纯度，因为避免了早期无需时不必要的非特异性核苷酸联接。
实践操作
对于hot-start PCR来说，其具体步骤与普通RT-qpcr仪类似，但是在实际操作时会使用含有化学抑制剂的一组专用混合物。当加入这组混合物到反应体系后，不仅包含了所有必需的一般组分，还包含了一些只在应用条件下才能去除阻碍因子的化合物。这些化合物能够将试管放在冰浴或者其他低温环境中以避免非特异性的核苷酸联接，而一旦试管放回恒温水浴器开始升温，当达到一定温度时，这些化学阻滞剂就会失效，从而使得聚合酶变得可用，并开始执行其正常功能，即从template DNA上读取信息并构建新的complementary strands.
比较分析
两者的主要区别就在于是否需要额外处理来防止非特异性的核苷酸联接。在标准Hot Start PCR中，由于是使用专门设计为hot start版本的reagents，因此需要特别注意添加顺序，以便正确地激活polymerase。而Cold Start 或 Standard PCR则没有这一限制，但是也因此可能会产生更多杂质，这对于一些精细实验来说是不够格调的情况。
此外，Hot Start还提供了一种所谓“Touchdown”程序，该程序涉及逐渐降低annealing temperature直到完成整个reaction cycle。这意味着即使存在一些不完全匹配，也能逐渐提高亲和力，最终得到更纯净、高质量结果。此技巧尤其适用于寻找具有高度保守区域但全局序列高度变动的人类基因家族中的成员。
总结来说，无论是Heat Start还是Cold Start，都可以成功完成molecular biology研究中的基本任务。但由于Heat Start提供了额外的手段来减少non-specific binding并优化结果，因此，对于那些追求最高质量数据的人来说，是首选选择。如果你的资源有限，那么Standard可能是一个足够有效且经济实惠的情形。不过，不同实验室根据他们自己的需求和偏好可能倾向於采用不同的方法。
